本研究利用16S rRNA測(cè)序分析對(duì)塑料圈微生物群落的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行了探究。
自然海洋環(huán)境中塑料圈微生物群落的結(jié)構(gòu)和組裝機(jī)制
The structure and assembly mechanisms of plastisphere microbial community in natural marine environment
作者：Sheng-Jie Zhanga , Yan-Hua Zeng a , Jian-Ming Zhu a , Zhong-Hua Cai a,b, Jin Zhou a,b*
期刊：Journal of Hazardous Materials
時(shí)間：2021.7.30
影響因子：10.588
一、文章摘要
最近，海洋環(huán)境中微塑料(MPs)上的微生物定植特征引起了全球的興趣。然而，許多研究只是描述了塑料圈微生物群落特征，卻沒(méi)有考慮微生物群落組裝背后的生態(tài)過(guò)程。在此，作者在1周、4周和8周進(jìn)行了三時(shí)間點(diǎn)暴露實(shí)驗(yàn)，并研究了天然沿海水體中聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯5種MP顆粒的定植動(dòng)力學(xué)。通過(guò)16S rRNA高通量測(cè)序，作者發(fā)現(xiàn)塑料圈微生物群落的多樣性和均勻性高于海水微生物群落(p < 0.05)，并且微生物定植受環(huán)境因素、聚合物類(lèi)型和暴露時(shí)間的共同影響。潛在功能和共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析表明，MP暴露增強(qiáng)了外源生物降解潛力，降低了MP微生物網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。同時(shí)，零模型分析表明，隨機(jī)過(guò)程比確定性過(guò)程在塑料圈微生物群落結(jié)構(gòu)的形成中發(fā)揮了更大的作用，擴(kuò)散限制在更大程度上決定了微生物的演替軌跡。該研究加強(qiáng)了大家對(duì)塑料相關(guān)微生物在定植過(guò)程中控制微生物群落模式的生態(tài)機(jī)制的理解。
二、主要內(nèi)容
1.MP暴露期間的環(huán)境參數(shù)
在實(shí)驗(yàn)中評(píng)估的物理參數(shù)中，從第1周到第8周，溫度和濁度變化顯著(p < 0.05)。相比之下，鹽度和pH值無(wú)顯著差異。在化學(xué)參數(shù)中，總有機(jī)碳(TOC)在0.808 ~ 2.258 mg/L范圍內(nèi)變化，第4周達(dá)到峰值，同時(shí)DO濃度達(dá)到最大值(6.84 mg/L)。此外，氮源物質(zhì)(NO3、NO2和NH4+)濃度在0.0025 ~ 0.072 mg/L之間波動(dòng)。
2. 不同MP基質(zhì)上細(xì)菌多樣性的時(shí)間分布
經(jīng)過(guò)組裝和質(zhì)量過(guò)濾，75個(gè)樣本共9441864條高質(zhì)量序列聚類(lèi)成208646個(gè)OTUs。利用α-多樣性估計(jì)細(xì)菌群落復(fù)雜度，包括豐富度（Chao1指數(shù)）和多樣性（Shannon指數(shù)）。在1-8周內(nèi)，除貝殼外的所有基質(zhì)的細(xì)菌豐富度和多樣性均有增加(p<0.05)。在第1周，與浮游細(xì)菌群落相比，除PVC外，MPs上的細(xì)菌豐富度和多樣性均無(wú)顯著差異。但隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，在第8周，MP顆粒的豐富度顯著高于海水細(xì)菌(p < 0.05)。同樣，PP和ABS也有較高的多樣性。在聚合物類(lèi)型方面，第1周，PVC的多樣性較低，而在第8周，PS的豐富度和多樣性最低。綜上所述，塑料圈群落多樣性受暴露時(shí)間和聚合物類(lèi)型的影響。
圖1 海水樣品和生物膜樣品中細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)（A）和Shannon指數(shù)（B）
3.塑料圈微生物群落與環(huán)境因子的聚類(lèi)分析及相關(guān)性研究
采用基于Bray-Curtis差異矩陣的NMDS方法，識(shí)別海水與塑料圈微生物群落的分離模式。三個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯的分離。海水、自然基質(zhì)(木材和貝殼)和MPs之間的微生物類(lèi)群在8周暴露期間具有不同的聚類(lèi)分布，此外，五種類(lèi)型的聚合物上的微生物聚類(lèi)分布隨時(shí)間變化而變化。在初始階段（1周），塑料圈群落緊密聚集。中期（4周），MP相關(guān)菌群的置信橢圓顯著偏離了水體和自然基質(zhì)中的相關(guān)菌群的置信橢圓(p < 0.05)。進(jìn)入最后階段（8周），PE、PP、PS、ABS上的細(xì)菌群落置信橢圓幾乎完全重疊，說(shuō)明這些材料上的細(xì)菌群落具有相似性。為了闡明環(huán)境因素對(duì)MP相關(guān)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，作者進(jìn)行了RDA分析，發(fā)現(xiàn)MPs上的細(xì)菌群落多樣性與鹽度、水流、pH、濁度、PO43-、NO3-呈正相關(guān)，與溫度呈負(fù)相關(guān)。此外，利用VPA分析評(píng)價(jià)環(huán)境參數(shù)對(duì)細(xì)菌分布的影響。在OTU數(shù)據(jù)中觀察到的微生物群落變化中，發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)物、物理和化學(xué)因素分別占14.3%、8.7%和4.6%。約有62.9%的微生物種類(lèi)變化不能用這些條件參數(shù)解釋?zhuān)f(shuō)明其他因素也影響了塑料圈群落。
圖2 不同時(shí)間點(diǎn)不同樣品間細(xì)菌群落多樣性的比較
4.不同暴露時(shí)間和基質(zhì)類(lèi)型情況下塑料圈微生物群落的分類(lèi)組成
利用16S rRNA基因分析不同聚合物類(lèi)型經(jīng)過(guò)不同暴露時(shí)間后細(xì)菌定植的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。浮游細(xì)菌群落主要為變形菌、藍(lán)藻菌、擬桿菌、浮霉菌和厚壁菌。第1周，所有樣品中，γ-變形菌和α-變形菌都是優(yōu)勢(shì)菌群，1周后，海水樣品中γ-變形菌的相對(duì)豐度顯著低于MP樣品。第4周生物膜樣品上擬桿菌(Bacteroidetes)的豐度顯著增加，第8周生物膜樣品上浮霉菌 (Planctomycetacia)的豐度顯著增加(p <0.05),表明相比生活在海水中，這些細(xì)菌更容易附著在顆粒上。另外，不同的聚合物類(lèi)型之間也觀察到顯著的差異，每種類(lèi)型都有一個(gè)特定的代表物種?？扑缴?，在初始暴露(1周)后，弧菌科、藍(lán)藻科、紅桿菌科和生絲單胞菌科(尤其是在PVC中)是5種MPs中相對(duì)豐度方面最具代表性的類(lèi)群。進(jìn)入第4周，，塑料和木材上黃桿菌的數(shù)量均高于貝殼。Family_XII 和Marinifilaceae 在貝殼上的分布均高于塑料。經(jīng)過(guò)8周的暴露，Pirellulaceae和Cryomorphaceae 在塑料上富集，而黃桿菌科和Family_XII 在木材和貝殼上的比例分別顯著增加(2-3倍)。通過(guò)LEfSe分析識(shí)別不同MP樣本之間的生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌群落的生物標(biāo)記物保持不變，還有一些樣品的生物標(biāo)志物隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而變化。這些結(jié)果表明，標(biāo)記菌屬在不同微塑料類(lèi)型上的定植具有底物優(yōu)先性。
圖3 不同樣品在綱(A)和科(B)水平上的相對(duì)豐度
5.塑料圈微生物群落的網(wǎng)絡(luò)分析
為了解細(xì)菌群落中類(lèi)群之間的潛在相互作用，作者通過(guò)計(jì)算成對(duì)的Spearman相關(guān)系數(shù)（ρ>0.8），對(duì)顯著的類(lèi)群進(jìn)行了共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析。發(fā)現(xiàn)海水微生物群落的相關(guān)OTUs數(shù)量最高，其次是MPs和貝殼生物膜，木材生物膜的相關(guān)OTUs數(shù)量最低。這說(shuō)明MP細(xì)菌群落網(wǎng)絡(luò)比海水浮游細(xì)菌更簡(jiǎn)單。根據(jù)Newman（2006）的觀點(diǎn)，如果模塊化指數(shù)>為0.4，則網(wǎng)絡(luò)具有模塊化結(jié)構(gòu)，可以分為幾個(gè)獨(dú)立的組。在本研究中，海水、MPs相關(guān)生物膜、木材/貝殼模塊化指數(shù)分別為0.981、0.459–0.992、0.647–2.847，表明形成的網(wǎng)絡(luò)具有模塊化輪廓。此外，高度連接的節(jié)點(diǎn)代表的是在保護(hù)微生物群落的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著作用的關(guān)鍵物種。利用這一標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)網(wǎng)絡(luò)中有10個(gè)OTUs被識(shí)別為關(guān)鍵種屬。塑料圈細(xì)菌群落的關(guān)鍵屬包括更廣泛的門(mén)，如變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)等。此外，微生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵物種也表現(xiàn)出一定的基質(zhì)偏好。
圖4 海水、微塑料生物膜、木材生物膜和貝殼生物膜等微生物群落的共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)分析
6.與MPs相關(guān)的微生物的潛在功能
為了研究底物類(lèi)型對(duì)生物膜群落中微生物功能多樣性的影響，作者利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)16S rRNA序列進(jìn)行了注釋。在比較海水和MP樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)，MPs上與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、脂質(zhì)代謝、細(xì)胞過(guò)程和信號(hào)傳導(dǎo)、外來(lái)生物降解和代謝相關(guān)的功能豐度顯著較高(p<0.05)。MPs和自然基質(zhì)之間的功能圖譜也有顯著差異。利用PVC作為具有代表性的基質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與PVC相比，核苷酸代謝和轉(zhuǎn)錄的代謝通路在木材和貝殼上富集。當(dāng)比較生物膜中微生物的預(yù)測(cè)功能時(shí)，可以觀察到五種底物類(lèi)型之間的微生物功能組成存在差異，盡管這些差異的幅度相對(duì)較低。以PE和PVC 為例，與復(fù)制和修復(fù)、遺傳信息處理、聚糖生物合成和代謝相關(guān)的通路在PE上富集，而與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡相關(guān)的通路在PVC 上富集。這些結(jié)果表明，MPs上微生物的代謝功能不同于周?chē)乃w和自然基質(zhì)。
圖5 海水和微塑料樣品中細(xì)菌群落(KEGG2級(jí))的功能圖譜
7.不同基質(zhì)上塑料圈微生物群落的組合
通過(guò)計(jì)算β-NTI值來(lái)評(píng)估兩種類(lèi)型的細(xì)菌群落組裝（確定性和隨機(jī)性）在不同基質(zhì)上的相對(duì)重要性。由于所有樣品的β-NTI值均在0.036~0.037之間，說(shuō)明隨機(jī)性是影響所有測(cè)試樣品細(xì)菌群落組裝的主要因素。Venn圖顯示，超過(guò)一半的MP OTUs在海水中被觀察到，表明大量的MP附著的原核生物可能來(lái)自于周?chē)乃?。這些相似之處可能是由于MPs為某些傾向于在表面定居的原核生物成員提供了合適的生態(tài)位。不同聚合物類(lèi)型的β-NTI值的差異可能反映了中性或非中性分布分區(qū)的遷移速率和分類(lèi)組成。結(jié)合使用加權(quán)β-NTI和基于Bray-curtis的Raup-Crick(RCbray)來(lái)評(píng)估不同組裝過(guò)程的相對(duì)貢獻(xiàn)，并使用零模型分析來(lái)估計(jì)影響塑料圈群落組成的生態(tài)過(guò)程。對(duì)于MPs和自然基質(zhì)上的細(xì)菌群落，擴(kuò)散限制是最重要的生態(tài)過(guò)程，并解釋了72.22–94.44%的群落更替。然而，在自由生活的微生物群落的數(shù)據(jù)集中，擴(kuò)散限制、均勻化擴(kuò)散和生態(tài)漂移分別占33.33%、28.79%和37.88%，表明各生態(tài)過(guò)程在推動(dòng)海水樣本中細(xì)菌群落聚集方面發(fā)揮相同重要性的作用。
圖6 β-NTI在不同樣本中的分布(A)及微生物組裝過(guò)程中分散限制、均質(zhì)化擴(kuò)散和不確定性過(guò)程的比例(B)
三、結(jié)論與亮點(diǎn)
本研究采用16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序，研究了MPs上不同類(lèi)型聚合物對(duì)細(xì)菌組裝圖譜的影響。有助于了解在塑料圈微生態(tài)系統(tǒng)中影響微生物結(jié)構(gòu)組裝的特定生態(tài)過(guò)程。為了更全面地了解塑料微生物的組裝機(jī)制和環(huán)境因素，分析其他參數(shù)，如水文特征、生態(tài)位類(lèi)型、基質(zhì)特征和更長(zhǎng)的研究時(shí)間，改變隨機(jī)性和確定性裝配過(guò)程之間的動(dòng)態(tài)平衡是必要的。
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